Application value of TVCDS quantitative parameters in the evaluation of the depth of myometrial invasion and treatment effects in patients with endometrial cancer
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摘要:目的探讨经阴道彩色多普勒超声(TVCDS)定量参数在子宫内膜癌(EC)病人肌层浸润深度及治疗效果评估中的应用价值。方法选取经TVCDS检查并由病理诊断确诊为EC病人100例, 其中肌层浸润82例, 无肌层浸润18例。比较无肌层浸润与肌层浸润病人临床资料、TVCDS定量参数、微血管密度(MVD); 比较不同手术效果病人TVCDS定量参数。分析EC病人肌层浸润影响因素, TVCDS定量参数、MVD、EC深肌层浸润深度的相关性。采用ROC曲线评价TVCDS定量参数与手术疗效的关系。结果无肌层浸润与肌层浸润病人的组织学分级、临床分期和淋巴转移差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)。肌层浸润组病人脉动指数(PI)、阻力指数(RI)、RI均低于无肌层浸润组(P < 0.05), MVD高于无肌层浸润组(P < 0.05)。深肌层组PI、RI均低于浅肌层组(P < 0.05), MVD高于浅肌层组(P < 0.05)。Logistic回归分析结果显示, 组织学分级、临床分期、淋巴结转移、PI、RI、MVD均为EC病人肌层浸润的影响因素(P < 0.05)。TVCDS定量参数PI、RI均与EC病人肌层浸润深度呈负相关关系(r=-0.719、-0.662, P < 0.05), MVD与肌层浸润呈正相关关系(r=0.578, P < 0.05), PI、RI与MVD均呈负相关关系(r=-0.575、-0.520, P < 0.05)。术效果良好病人PI、RI均明显高于手术效果不佳病人(P < 0.01)。ROC曲线分析显示, PI、RI预测手术疗效的AUC分别为0.782、0.759, PI与RI联合应用于手术疗效预测的AUC为0.863, 高于PI、RI单独预测的诊断价值。结论EC病人TVCDS定量参数PI、RI在肌层浸润深度、组织学分级、临床分期、淋巴转移及手术效果评估中具有重要应用价值, 可为EC诊断及术前、预后评估提供重要参考信息。Abstract:ObjectiveTo explore the application value of the quantitative parameters of transvaginal color Doppler sonography(TVCDS) in the evaluation of the depth of myometrial invasion and treatment effects in patients with endometrial cancer(EC).MethodsA total of 100 EC patients diagnosed by TVCDS examination and pathology, which included 82 cases with muscular infiltration and 18 cases without muscular infiltration.The clinical data, quantitative parameters of TVCDS and microvascular density(MVD) between patients with and without muscle layer infiltration and muscle layer infiltration were compared.The quantitative parameters of TVCDS among patients with different surgical outcomes were compared.The influencing factors of muscle layer infiltration in EC patients were analyzed, and the correlation between quantitative parameters of TVCDS, MVD and depth of deep muscle layer infiltration in EC patients was analyzed.The ROC curve was used to evaluate the relationship between TVCDS quantitative parameters and surgical efficacy.ResultsThe differences of the histological grade, clinical stage, and lymphatic metastasis were statistically significant between two groups(P < 0.05).The perfusion index(PI) and resistance index(RI) in muscle layer infiltration group were lower than those in non-muscular layer infiltration group(P < 0.05), and the MVD in muscle layer infiltration group was higher than that in non-muscular layer infiltration group(P < 0.05).The perfusion index and resistance index in deep muscle layer group were lower than those in superficial muscle layer group(P < 0.05), and the MVD in deep muscle layer group was higher than that in superficial muscle layer group (P < 0.05).The results of logistic regression analysis showed that the hhistological grade, clinical stage, lymph node metastasis, PI, RI and MVD were the influencing factors of muscle layer infiltration in EC patients(P < 0.05).The TVCDS quantitative parameters PI and RI were negatively correlated with the depth of muscle layer infiltration(r=-0.719, -0.662, P < 0.05), the MVD was positively correlated with the muscle layer infiltration(r=0.578, P < 0.05), and the PI, RI were negatively correlated with MVD in EC patients(r=-0.575, -0.520, P < 0.05).The PI and RI of patients with good operation results were significantly higher than those with poor operation results(P < 0.01).The ROC curve analysis showed that the area under curve(AUC) of PI and RI in predicting surgical efficacy were 0.782 and 0.759, respectively.The AUC of PI combined with RI in predicting surgical efficacy were 0.863, which was higher than that of the diagnostic value of PI and RI alone.ConclusionsThe quantitative parameters PI and RI of TVCDS in EC patients have important application value in the depth of myometrial invasion, histological grade, clinical staging, lymphatic metastasis and evaluation of surgical effect, which can provide important reference information in the diagnosis of EC and evaluation of preoperative and prognosis.
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宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，发病率呈上升趋势，且发病年龄逐渐年轻化。90%以上的宫颈癌病人都伴有高危人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)持续感染。HPV是一类具有严格宿主范围和组织特异性的病毒，主要感染人的皮肤或黏膜上皮细胞，引起感染部位发生病变。目前已知的HPV基因型有100多种，其中约40种与生殖道感染有关，且不同HPV亚型对宫颈上皮的致病性不同。根据HPV型别与宫颈癌发生危险性的高低分为高危型HPV和低危型HPV。高危型HPV与宫颈癌及子宫上皮内瘤变(CIN)相关，低危型HPV常引起生殖道疣等良性病变。本文采用流式荧光杂交法检测7 709例女性宫颈脱落细胞HPV基因型，分析HPV感染的阳性率和年龄段的关系及HPV亚型感染分布特点。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选择2016年1月至2018年6月到我院妇科就诊及体检的女性7 709例为研究对象，年龄16~92岁。
1.2 仪器与试剂
HPV基因分型检测试剂盒(流式荧光杂交法)由上海透景生命科技股份有限公司提供，本试剂盒可检测27种HPV亚型，其中高危型包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68和82，低危型包括HPV6、11、40、42、43、44、55、61、81和83。Bioer Lift Express基因扩增仪由杭州博日科技有限公司提供。Luminex 200型基因分析仪由美国路明克斯贸易有限公司提供。
1.3 研究方法
1.3.1 样本采集
先用窥阴器暴露宫颈，再用配套宫颈刷轻轻转动4~5圈，采集足量的上皮细胞样本，然后放入专用细胞保存液中，贴好标签，送至检验科检测。
1.3.2 样本处理
将样品保存管在漩涡振荡器上振荡30 s，确保脱落细胞均匀悬浮，取200 μL样品于1.5 mL离心管中，14 000 rpm离心3 min，小心吸弃上清。每管加入200 μL核酸提取试剂，振荡混匀。瞬时离心后置于100 ℃金属恒温浴中15 min。然后14 000 rpm离心6 min，留取上清液备用。
1.3.3 PCR扩增
按每个样本引物混合液5 μL，PCR预混液10 μL和Taq酶0.8 μL将试剂分装于PCR反应管内，然后加入5 μL核酸模板。将PCR反应管置于基因扩增仪中扩增。扩增条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，5个循环；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 3 min。
1.3.4 基因杂交
先将22 μL微球杂交液加入微孔杂交板，然后加入3 μL PCR扩增产物，并抽吸几次加以混匀，封膜后，在PCR仪中95 ℃变性5 min，48 ℃ 30 min杂交，使探针-扩增产物结合。每孔加入75 μL链霉亲和素标记的藻红蛋白，吹打混匀，再次封膜，48 ℃孵育15 min。将微孔杂交板置Luminex 200多功能流式分析仪上进行检测。感染率=阳性数/总调查例数×100%，检出率=阳性数/调查数×100%。
1.4 统计学方法
采用χ2检验。
2. 结果
2.1 HPV总体感染情况
7 709例送检样本中检出阳性1 237例，总阳性率为16.05%，以高危型感染为主(见表 1)。
表 1 上海市宝山区HPV感染情况检测项目 阳性数 构成比/% 感染率/% 高危型 833 67.34 10.81 低危型 254 20.53 3.29 混合型 150 12.13 1.95 合计 1 237 100.00 16.05 2.2 HPV各亚型感染分布特征
感染率大于1%的亚型依次为HPV52、16、53、58、39、61，其中高危型主要是HPV52、16、53、58、39，前5位低危型主要是HPV61、43、55、81、6(见表 2、3)。
表 2 高危型HPV分布情况亚型 阳性数 构成比/% 感染率/% 亚型 阳性数 构成比/% 感染率/% 亚型 阳性数 构成比/% 感染率/% HPV16 170 10.35 2.21 HPV39 103 6.27 1.34 HPV58 129 7.86 1.67 HPV18 64 3.90 0.83 HPV45 18 1.10 0.23 HPV59 60 3.65 0.78 HPV26 1 0.06 0.01 HPV51 57 3.47 0.74 HPV66 42 2.56 0.54 HPV31 20 1.22 0.26 HPV52 197 12.00 2.56 HPV68 26 1.58 0.34 HPV33 49 2.98 0.64 HPV53 150 9.14 1.95 HPV82 22 1.34 0.29 HPV35 27 1.64 0.35 HPV56 59 3.59 0.77 表 3 低危型HPV分布情况亚型 阳性数 构成比/% 感染率/% 亚型 阳性数 构成比/% 感染率/% HPV6 48 2.92 0.62 HPV44 43 2.62 0.56 HPV11 26 1.58 0.34 HPV55 62 3.78 0.80 HPV40 17 1.04 0.22 HPV61 85 5.18 1.10 HPV42 28 1.71 0.36 HPV81 57 3.47 0.74 HPV43 66 4.02 0.86 HPV83 16 0.97 0.21 2.3 各年龄段HPV亚型感染情况
HPV感染人群主要分布在41~50岁和31~40岁年龄组，各年龄组感染率差异有统计学意义(χ2=24.24，P < 0.01)(见表 4)。
表 4 各年龄组HPV感染情况年龄/岁 n 阳性数 检出率/% 构成比/% 感染率/% 16~20 32 8 25.00 0.65 0.10 21~30 1 231 215 17.47 17.38 2.79 31~40 2 352 347 14.75 28.05 4.50 41~50 3 033 478 15.76 38.64 6.20 51~60 736 122 16.58 9.86 1.58 61~70 255 62 24.31 5.01 0.80 71~ 70 5 7.14 0.40 0.06 合计 7 709 1 237 16.05 100.00 16.05 2.4 HPV单基因型和混合基因型感染情况
在1 237例HPV阳性标本中，以单基因型感染为主，双重感染次之，少数人群存在多重感染(见表 5)。
表 5 HPV感染类型感染类型 n 构成比/% 感染率/% 单基因型 958 77.44 12.43 双重基因型 198 16.01 2.57 多重基因型 81 6.55 1.05 合计 1 237 100.00 16.05 3. 讨论
宫颈癌是一种由感染引起的恶性疾病，其发病与HPV感染的型别有关，持续性高危型HPV感染是主要危险因素，也是引起宫颈癌前病变和宫颈癌的主要诱因[1]。因此，对女性群体进行HPV筛查具有重要意义。
HPV基因型分布存在地区差异。在我国，北京地区主要以HPV52、58、16亚型为主[2]，天津地区主要以HPV16、56、58亚型为主[3]，武汉地区主要以HPV16、52、58亚型为主[4]，浙江地区则以HPV16、11、58和6亚型为主[5]，上海奉贤地区主HPV16、52、58亚型为主[6]。本研究结果显示，受检7 709例样本中，感染率居前5位的是HPV52、16、53、58、39亚型，与国内报道的大部分区域基本相同[7-8]，同时也基本符合东亚地区HPV感染型别[9]。近年研究[10]发现，HPV基因型别分布也在随时间而改变，HPV18从感染优势基因逐渐下降，可能与疫苗的接种有关，也可能与HPV18的较强致死性相关。有研究[11]表明，HPV18主要感染鳞柱交界处的柱状上皮，因此较少发展为CINⅡ、Ⅲ，但具有发展为子宫颈腺癌和鳞状细胞癌的双向潜能。HPV18虽不常见，但致瘤性强，且HPV18感染疾病进展快，转移早，预后差[12]。有研究[13]表明，HPV18阳性的子宫颈癌病人较HPV16阳性者预后差。这就提示HPV疫苗的研发也要根据感染优势基因分布情况同步推进。
本研究发现，在1 237例阳性标本中，HPV多为单基因型感染，占感染人数的77.44%，且以单一高危型为主，常见高危型依次为HPV52、16、53、58、39亚型；双重感染者占感染人数的16.01%，多重感染者占感染人数的6.55%，最多检测到6重感染。在二重及多重感染中，最常见HPV52型合并的感染，其次为HPV16或HPV53型。施启丰等[14]研究发现，深圳地区二重及多重感染中，最常见HPV16型合并的感染，其次为HPV58和HPV52型，说明HPV混合基因型也存在地区差异。研究[15]表明，多重感染尤其是多重高危型感染会大大增加宫颈癌变风险，提示临床上应重视多重感染者，建议积极治疗并严密追踪随访，降低宫颈癌的发生。
各年龄段的HPV感染率有明显差异，提示HPV的感染率与年龄有关。本研究中，HPV感染的高峰年龄段为41~50岁，这与钟伟明[16]和方莉等[17]的研究结果一致，而李小欢等[18]则认为21~25岁为HPV感染高峰期，可能由于选取的调查对象和区域不同等原因造成。另外，HPV感染受多种因素影响，过早性生活、多个性伴侣、多产、密产、早年分娩、流产等可增加病毒感染机会；生殖道其他微生物的感染(如单纯疱疹病毒、淋菌等)导致生殖道黏膜受损，也会增加病毒感染机会；长期口服激素类避孕药、吸烟、饮酒等也会增加病毒侵袭机会。41~50岁年龄段正处于围绝经期，此时由于机体内分泌紊乱而引起各器官尤其是卵巢功能失调、雌激素水平开始下降，机体对外界有害因素的抵抗力减低，从而易感染HPV。而21~25岁可能由于这一年龄段女性性生活比较活跃，在生理卫生方面未给予充分重视等因素也会造成HPV感染率增高。提示我们应加强围绝经期和年轻妇女的HPV筛查力度。
接种HPV疫苗是预防宫颈癌的有效手段，目前已经上市的HPV预防性疫苗有2价、4价和9价疫苗，2价疫苗主要针对HPV16、18亚型，4价疫苗主要针对HPV16、18、6、11亚型，9价疫苗在4价疫苗基础上增加了HPV31、33、45、52、58五种亚型。本研究发现，上海市宝山区感染率居前5位的高危型是HPV52、16、53、58、39，前5位低危型是HPV61、43、55、81、6，后期还需多地区大样本研究来验证HPV感染的高危型别，为HPV疫苗的研发提供有力依据，以达到更好的预防效果。
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表 1 无肌层浸润与肌层浸润病人临床资料比较(x±s)
临床资料 肌层浸润(n=82) 无肌层浸润(n=18) χ2 P 年龄/岁 < 50 58(70.73) 10(55.56) 1.56 >0.05 ≥60 24(29.27) 8(44.44) 绝经 是 51(62.20) 12(66.67) 0.13 >0.05 否 31(37.80) 6(33.33) 腺癌 是 60(73.17) 13(72.22) 0.05 >0.05 否 22(26.83) 5(27.78) 组织学分级 G1 12(14.63) 10(55.56) 2.73 < 0.01 G2 51(62.20) 5(27.78) G3 19(23.17) 3(16.67) 临床分期 Ⅰ~Ⅱ 37(45.12) 13(72.22) 4.34 < 0.05 Ⅲ~Ⅳ 45(54.88) 5(27.78) 淋巴结转移 是 26(31.71) 1(5.56) 3.88 < 0.05 否 56(68.29) 17(94.44) 
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表 2 无肌层浸润与肌层浸润病人TVCDS定量参数、MVD比较(x±s)
分组 n PI RI MVD/(个/HP) 肌层浸润组 82 0.60±0.15 0.42±0.09 36.24±16.85 深肌层组 27 0.52±0.13 0.37±0.07 40.12±10.74 浅肌层组 55 0.64±0.17* 0.44±0.10* 34.34±9.12* 无肌层浸润组 18 0.84±0.22△ 0.58±0.11△ 20.41±9.84△ F — 19.03 60.56 22.85 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 3.23 3.26 2.54 配对t检验：与深肌层组比较*P < 0.05；与肌层浸润组比较△P < 0.05
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表 3 EC病人肌层浸润影响因素分析
因素 B SE Waldχ2 P OR 95%CI 组织学分级(对照=G1) G2 1.430 0.347 16.988 < 0.05 4.180 2.274~7.682 G3 1.767 0.321 30.301 < 0.05 5.853 3.331~10.285 临床分期(对照=Ⅰ~Ⅱ) Ⅲ~Ⅳ 1.556 0.394 15.596 < 0.05 4.740 2.315~7.704 淋巴结转移(对照=否) 是 1.744 0.380 21.068 < 0.05 5.721 2.337~9.809 PI(对照为≤平均数) >平均数 -0.727 0.215 11.422 < 0.05 0.484 0.327~0.715 RI(对照为≤平均数) >平均数 -0.724 0.206 12.346 < 0.05 0.485 0.298~0.789 MVD(对照为≤平均数) >平均数 1.640 0.362 20.525 < 0.05 5.155 2.597~10.234 赋值：G1=1，G2=2，G3=3；临床分期：Ⅰ~Ⅱ=1，Ⅲ~Ⅳ=2；淋巴结转移：否=0，是=1；PI、RI、MVD：以平均数为界，≤平均数=1，>平均数=2
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表 4 不同手术效果病人TVCDS定量参数比较(x±s)
分组 n PI RI 效果良好组 80 0.68±0.14 0.49±0.12 效果不佳组 20 0.47±0.10 0.30±0.06 t — 6.31 6.85 P — < 0.01 < 0.01
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表 5 TVCDS定量参数评价手术疗效的价值
指标 AUC 95%CI 约登指数 P 截断值 敏感度/% 特异度/% PI 0.782 0.688~0.859 0.550 < 0.01 0.60 75.00 80.00 RI 0.759 0.663~0.839 0.438 < 0.01 0.47 95.00 48.75 联合评估 0.863 0.780~0.923 0.600 < 0.01 PI 0.62、RI 0.50 85.00 75.00
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[1] MATSUO K, MOEINI A, MACHIDA H, et al. Tumor characteristics and survival outcome of endometrial cancer arising in adenomyosis: an exploratory analysis[J]. Ann Surg Oncol, 2016, 23(3): 959. doi: 10.1245/s10434-015-4952-y
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