Effect of deep neuromuscular blockade on postoperative rehabilitation in patients undergoing laparoscopic colorectal-carcinoma surgery
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摘要:目的评价深度肌松对腹腔镜结直肠癌病人术后康复的影响。方法择期行腹腔镜结直肠癌手术病人78例，随机分为2组，各39例，分为中度肌松组（A组）和深度肌松组（B组）。A组在肌松监测下泵注苯磺顺阿曲库铵注射液，维持中度肌松；B组在肌松监测下泵注苯磺顺阿曲库铵注射液，维持深度肌松。2组病人术中容量管理均采用目标导向液体治疗策略，入复苏室后继续进行肌松监测，在肌松监测仪指导下给予肌松拮抗药及拔除气管导管。记录并比较2组病人手术视野评分、平均气腹压及平均气道压，恢复指数、拔管时间及复苏室驻留时间，术后疼痛及恶心、呕吐评分，术后早期恢复质量评分、胃肠道功能恢复情况及住院时间。结果B组平均气腹压、平均气道压均低于A组（P < 0.01），B组苯磺顺阿曲库铵使用量、恢复指数、拔管时间均高于A组（P < 0.01）。B组病人术后各时间段肩痛评分均低于A组病人（P < 0.01），术后6、24 h，B组病人内脏痛及恶心呕吐评分均低于A组病人（P < 0.01）。B组术后1、3 d的恢复质量评分均高于A组（P < 0.01）。B组排气时间、排便时间、肠鸣音恢复时间及住院时间均短于A组（P < 0.01）。结论将深度肌松应用于腹腔镜结直肠癌手术中，能够在保证术野的前提下降低气腹压力，提高病人早期恢复质量，促进胃肠道功能恢复，有利于病人术后康复，为围术期麻醉管理提供思路。Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of deep neuromuscular blockade on postoperative rehabilitation of patients undergoing laparoscopic colorectal-carcinoma surgery.MethodsSeventy-eight patients undergoing laparoscopic colorectal-carcinoma surgery were randomly divided into two groups as moderate neuromuscular blockade group(Group A, n=39) and deep neuromuscular blockade group(Group B, n=39).Patients in group A were pumped with cisatracurium under muscle relaxation monitoring to maintain the level of modern neuromuscular blockade.Other patients in group B were pumped with cisatracurium under muscle relaxation monitoring to maintain the level of deep neuromuscular blockade.Goal-directed fluid therapy was performed for intraoperative volume management in both groups.After entering the postanesthesia care unit, neuromuscular blockade monitoring was continued for patients in both groups.Then, muscle relaxation antagonists and extubation of endotracheal tubes were performed in both groups under the guidance of neuromuscular monitoring.The surgical field score, mean pneumoperitoneum pressure, and mean airway pressure were recorded; the time of recovery index, the time of removing the tracheal intubation, and the stay time in the postanesthesia care unit were recorded; the scores of postoperative pain, nausea, and vomiting were recorded; the score of recovery quality scale, recovery of gastrointestinal function, and hospital stay were recorded.ResultsThe mean artificial pneumoperitoneum pressure and mean airway pressure in group B were lower than those in group A(P < 0.01).The usage of cisatracurium, the time of TOF ratio from 0.25 to 0.75, and the time of removing the tracheal intubation in group B were higher than those in group A(P < 0.01).The shoulder pain scores of patients in group B were lower than those in group A at all postoperative periods(P < 0.01).At 6 and 24 hours after operation, the scores of visceral pain, nausea, and vomiting in group B were lower than those in group A(P < 0.01).At 1 and 3 days after operation, the score of recovery quality in group B was higher than that in group A(P < 0.01).The exhaust time, defecation time, bowel sound recovery time and hospital stay in group B were shorter than those in group A(P < 0.01).ConclusionsThe application of deep neuromuscular blockade in laparoscopic colorectal-carcinoma surgery can reduce the pneumoperitoneum pressure under the premise of ensuring the surgical field, improve the early postoperative recovery quality of patients, promote the gastrointestinal function recovery, and benefit the postoperative rehabilitation of patients, providing ideas for perioperative anesthesia management.
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长链3-羟酰基辅酶A脱氢酶(LCHAD)是线粒体内长链脂肪酸氧化循环关键限速酶之一，有报道[1]证实，其胎盘组织表达水平与妊娠期病理性损伤关系密切，包括急性脂肪肝、早发子痫前期及溶血、肝酶升高和血小板减少(HELLP)综合征。有报道[2]提示，抗磷脂综合征(APS)孕妇往往合并子痫前期或HELLP综合征。近年来研究[3]表明，子痫前期、HELLP综合征及APS孕妇体内脂肪酸氧化代谢异常和脂质沉积水平存在明显差异；同时子痫前期不同类型病人间亦存在明显脂肪酸氧化代谢差异。部分重度子痫前期及其他类型病理妊娠状态中可见LCHAD基因mRNA/蛋白表达水平异常，但以上改变是否能够通过表观遗传学影响基因表达水平尚不清楚[4]。甲基化是目前表观遗传学重要研究领域之一，并可参与到基因调控中，已有报道[5]显示，长链脂肪酸异常累积可造成滋养细胞LCHAD基因甲基化水平明显变化，进而影响相关基因表达。本研究探讨LCHAD基因表达及甲基化与病理妊娠状态相关性，为临床针对不同类型病理妊娠病人诊治提供参考。现作报道。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
纳入我院2014-2019年收治的早发重度子痫前期病人18例(A组)、HELLP综合征15例(B组)、APS 17例(C组)，同时选取正常妊娠女性20名作为对照组，所有孕妇均为自然受孕、单胎妊娠。诊断标准[6]: (1)早发重度子痫前期指重度子痫前期于妊娠20~32周发生，血压≥160/110 mmHg，24 h尿蛋白量>2.0 g或≥2+，并可见持续头痛、视觉障碍、上腹痛症状；(2)HELLP综合征指发生早发重度子痫前期同时合并溶血，乳酸脱氢酶>5.01 μmol·s-1·L-1，天门冬氨酸氨基转移酶>70 U/L，血小板计数<100×109/L；(3)APS指间隔6周连续检测≥2次，aCL-IgG和/或aCL-IgM抗体(+)；同时排除伴原发性高血压、肝肾疾病及其他合并症，宫内胎儿死亡及合并胎儿染色体疾病史。研究方案符合《赫尔辛基宣言》要求，且病人及家属知情同意。
1.2 临床资料收集
收集病人年龄、孕周、分娩孕周、体质量指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、24 h尿蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血肌酐(Scr)等临床资料。
1.3 标本处理方法
(1) 血液标本: 抽取静脉血后加入含促凝剂和分离胶试管内，2 500 r/min离心15 min，56 ℃水浴30 min；采用醋酸纤维膜过滤器过滤除菌，-80 ℃储存。(2)原代滋养细胞: 绒毛组织来源于自愿行人工流产、胚胎正常、无妊娠合并症/并发症女性，年龄(25.39±0.50)岁，孕周(7.32±0.48)周，其中孕周根据末次月经时间、超声及病理组织学检查确定。绒毛组织经负压吸引获得后在无菌0.9%氯化钠溶液保存，参考DING等[7]方法完成原代细胞滋养层细胞分离, 获得原代滋养细胞。
1.4 LCHAD基因甲基化水平与mRNA表达检测
(1) 细胞总DNA提取: 滋养细胞培养及处理根据文献[8]操作，采用DNA提取试剂盒提取滋养细胞总DNA，每份DNA样品总量1~3 μg，保证浓度>50 ng/μL，OD260/OD280=1.8~2.0，在-20 ℃保存。(2)LCHAD基因启动子区甲基化位点数量和位置检测: 查询Genbank数据库获取LCHAD基因转录起始位点上游2 000 bp序列，采用MethPrimer软件确定LCHAD基因启动子CpG岛甲基化位点数量和位置，参考标准: CG含量>55%，长度>200 bp，ObsCpG/ExpCpG>0.60。(3)甲基化程度检测: 采用MassARRAY甲基化DNA定量分析平台；选择Epidesigner软件完成LCHAD基因启动子区CpG岛引物设计并完成扩增，序列长度558 bp；检测DNA样品浓度和纯度合格后行亚硫酸氢钠处理，甲基化胞嘧啶未发生改变，未发生甲基化胞嘧啶被转化为尿嘧啶。标化后DNA继续行PCR扩增，选择5 μL反应体系，扩增条件: 94 ℃预变性4 min；94 ℃变性25 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共48个循环；72 ℃终延伸3 min。甲基化程度(%)=甲基化浓度/(未甲基化浓度+甲基化浓度)×100%。(4)实时荧光RT-PCR技术检测LCHAD mRNA: 选择TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA；引物和探针设计合成由Invitrogen公司完成，内参为GAPDH，扩增条件: 95 ℃预变性2 min；93 ℃变性15 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸60 s，共45个循环；72 ℃终延伸3 min。分析扩增曲线和Ct值，计算LCHAD mRNA相对表达水平。引物序列见表 1。
表 1 引物序列基因 序列 LCHAD 上游5′-CCT CGC CTT TGC CGA TCC-3′ 下游3′-GGA TCT TCA TGA GGT AGT CAG TC-5′ GAPDH 上游5′-GGT GAA GGT CGG AGT CAA CG-3′ 下游3′-CAA AGT TGT CAT GGA TGH ACC-5′ 1.5 统计学方法
采用t检验、方差分析、q检验和相关分析。
2. 结果
2.1 一般资料比较
A组、B组分娩孕周低于对照组(P < 0.05)，C组分娩孕周高于B组(P < 0.05)；A组、B组SBP、DBP及24 h尿蛋白水平均高于对照组(P < 0.05)；B组ALT和Scr水平均高于对照组(P < 0.05)(见表 2)。
表 2 4组一般资料比较(x±s)分组 n 年龄/岁 检测孕周/周 分娩孕周/周 BMI/(kg/m2) SBP/mmHg DBP/mmHg 24 h尿蛋白/g ALT/(U/L) Scr/(mg/dL) A组 18 31.10±2.79 31.13±1.42* 32.49±2.16* 31.11±1.67 171.86±12.90* 115.31±11.80* 7.09±1.23* 27.09±6.28 0.29±0.12 B组 15 30.52±3.34 30.24±1.55 31.32±2.45* 31.57±1.50* 175.48±19.69* 118.17±6.97* 7.84±1.56*# 115.56±19.06*# 2.53±0.96*# C组 17 31.60±2.92 29.57±1.36# 38.60±2.28#▲ 30.73±1.27 124.55±11.34*#▲ 80.37±4.97#▲ 0.01±0.00#▲ 24.09±5.45▲ 0.37±0.17▲ 对照组 20 30.04±2.57 29.82±1.44 38.95±2.90 30.17±1.01 110.90±13.51 78.87±4.66 0.00±0.00 24.97±5.64 0.39±0.20 F — 1.01 4.05 44.74 3.28 91.27 137.15 355.65 308.65 85.83 P — >0.05 < 0.05 < 0.01 < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 8.340 2.074 6.156 1.88 208.82 58.409 0.906 103.576 0.218 q检验: 与对照组比较*P < 0.05；与A组比较#P < 0.05；与B组比较▲P < 0.05 2.2 LCHAD基因启动子区甲基化水平比较
A组-899、-853、-615、-984、-774、-727及-579位点甲基化水平高于对照组，-853位点甲基化水平高于B组，-899、-853及-615位点甲基化水平高于C组(P < 0.05)；B组-899、-853、-774及-615位点甲基化水平高于对照组，-899、-853及-615位点甲基化水平高于C组(P < 0.05)(见表 3)。
表 3 4组LCHAD基因启动子区甲基化水平比较(x±s)分组 n -984 -960 -899 -853 -811 -774 -727 -615 -579 A组 18 5.54±2.40* 1.93±1.47 12.53±4.42* 13.72±3.55* 4.39±1.47 4.87±1.43 5.41±1.56* 17.10±3.15* 6.10±1.79 B组 15 0.11±0.08# 2.72±1.56* 14.05±5.84* 11.30±3.42*# 5.07±2.46 1.19±1.15 0.48±0.22# 19.07±4.38*# — C组 17 0.20±0.13# 1.10±0.64▲ 3.21±1.54#▲ 2.72±0.96#▲ 4.86±2.35 — — 3.35±1.47#▲ — 对照组 20 0.00±0.05 1.73±0.87 3.14±1.69 1.39±0.60 4.65±1.27 — 0.20±0.10 2.72±1.13 1.55±0.61 F — 88.71 5.11 43.43 111.83 0.39 8.03■ 182.67 175.29 10.71■ P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 1.49 1.39 13.664 6.054 3.643 — 0.845 7.517 — ■示t值。q检验: 与对照组比较*P < 0.05；与A组比较#P < 0.05；与B组比较▲P < 0.05 2.3 LCHAD mRNA表达水平比较
A组、B组、C组LCHAD mRNA表达水平均低于对照组(P < 0.05)(见表 4)。
表 4 不同组LCHAD mRNA表达水平比较(x±s)分组 n LCHAD mRNA水平 F P MS组内 A组 18 0.05±0.01* B组 15 0.05±0.01* 6.052 < 0.01 1.354 C组 17 0.04±0.01* 对照组 20 0.08±0.01 q检验: 与对照组比较*P < 0.05 2.4 LCHAD基因甲基化水平与mRNA表达相关性
A组LCHAD基因-899、-853、-727、-615及-579位点甲基化水平与mRNA表达水平均呈负相关关系(P < 0.05)；但其-984、-960、-811、-774及-595位点甲基化水平与mRNA表达水平均无明显相关关系(P>0.05)。B组LCHAD基因-899、-853及-615位点甲基化水平与mRNA表达水平均呈负相关关系(P < 0.05)；但其-960、-811及-774位点与mRNA表达水平均无明显相关关系(P>0.05)。C组和对照组LCHAD基因全部位点甲基化水平与mRNA表达水平均无明显相关关系(P>0.05)(见表 5)。
表 5 LCHAD基因甲基化水平与mRNA表达的相关性分析(r)分组 n -984 -960 -899 -853 -811 -774 -727 -615 -595 -579 A组 18 -0.635 -0.674 -0.944* -0.855* -0.525 -0.794 -0.822* -0.905* -0.725 -0.853* B组 15 — -0.575 -0.677* -0.955* -0.631 -0.404 — -0.905* — — C组 17 — 0.525 0.027 0.308 -0.884 — — -0.255 — — 对照组 20 — 0.684 -0.825 -0.544 0.357 — — 0.485 — — *P < 0.05 3. 讨论
子痫前期是妊娠期常见和严重并发症之一，而HELLP综合征被认为是子痫前期并发症，但亦可在无子痫前期状态下发生[9]。有研究[10]显示，部分子痫前期和HELLP综合征病人可见脂肪酸氧化代谢、脂代谢异常。LCHAD已被证实与子痫前期、HELLP综合征脂肪酸氧化障碍发生关系密切，但需要注意无LCHAD基因缺陷子痫前期产妇体内也可见LCHAD基因表达水平降低，这一结果提示基因突变并非影响LCHAD基因表达唯一遗传因素，遗传因素与环境因素共同作用可能更为关键[11]。不同临床表现子痫前期和HELLP综合征孕妇胎盘滋养细胞中LCHAD基因表达变化程度亦存在明显差异，而在不同方法建立的子痫前期模型小鼠中亦可观察到程度不一的LCHAD基因表达改变[12]；有报道[13]提示，子痫前期孕妇DNA甲基化水平与血压呈明显正相关关系。另有研究[14]证实，LCHAD基因接受甲基化修饰后基因表达沉默，提示DNA甲基化在相关基因转录调控中发挥着重要作用；而DNA甲基化是子痫前期病变中主要表观遗传学修饰类型之一，且多见于CpG岛。
本研究结果显示，不同病理妊娠状态病人CG位点甲基化水平存在明显差异，其中早发重度子痫前期和HELLP综合征孕妇-899、-853及-615位点甲基化水平高于对照组。目前认为胎盘滋养细胞中脂肪酸氧化代谢障异常、代谢底物堆积及环境因素改变均可能引起基因从头甲基化反应增加，进而影响子痫前期或HELLP综合征病情进展；同时从头甲基化具有可逆性，子痫前期和HELLP综合征孕妇妊娠终止后病情好转可能与去甲基化反应发生有关[15]。本研究中，早发重度子痫前期孕妇-595位点甲基化水平升高，但HELLP综合征孕妇并无甲基化出现，笔者认为这一现象可能与疾病间脂肪酸氧化代谢异常程度不一，使得LCHAD基因不同位点甲基化修饰模式存在差异有关。
本研究结果显示，处于病理妊娠状态和健康孕妇滋养细胞中LCHAD基因启动子区部分CG位点都处于低甲基化和/或无甲基化状态，表明以上位点特定基因作用位于低甲基化甚至无甲基化状态，与以往其他基因甲基化报道[16]结果接近，即并非全部CG位点均受环境因素影响而出现甲基化修饰，可能与与CG所在位置或有无结合启动子有关。
脂质代谢及脂质过氧化反应异常已被证实在APS发病过程中发挥着关键作用，有报道[17]显示，孕晚期APS进展为子痫前期比例超过50%，严重者甚至出现HELLP综合征；同时APS与早发重度子痫前期和HELLP综合征孕妇滋养细胞脂肪酸代谢、线粒体功能间均存在较大差异。本研究中，早发重度子痫前期和HELLP综合征孕妇LCHAD基因-899、-853及-615位点甲基化水平升高，而早发重度子痫前期孕妇中-595位点甲基化水平亦高于对照组，但APS孕妇并未观察到以上位点甲基化程度变化；以上数据提示相较于早发重度子痫前期和HELLP综合征孕妇，APS孕妇DNA甲基化反应对于脂肪酸代谢和氧化应激紊乱敏感性较低。笔者认为对于不同病理妊娠状态下产妇存在不同LCHAD基因甲基化修饰模式和脂肪酸代谢通路，导致脂肪酸代谢异常程度出现差异。
本研究中，早发重度子痫前期和HELLP综合征孕妇LCHAD mRNA表达水平降低，并与DNA甲基化水平呈负相关关系；其中与-899、-853及-615三个高甲基化位点关系尤为密切；而对照组各个CG位点均处于低甲基化水平，并与LCHAD mRNA表达水平无明显相关性，以上数据提示以上位点可能通过脂质代谢调节参与到早发重度子痫前期脂质代谢障碍进展过程中。有研究[18]证实，甲基化修饰与脂肪酸氧化代谢、动脉粥样硬化性改变等关系密切。而妊娠期脂肪酸脂质代谢异常及毒性产物堆积均可能诱发LCHAD基因甲基化水平升高，反馈调节LCHAD mRNA表达，导致滋养细胞脂肪酸氧化代谢紊乱加重，进而诱发子痫前期等多种病理妊娠状态发生。本研究中，甲基化水平较低位点甲基化水平与LCHAD mRNA表达无明显相关性，表明CG位点低甲基化往往无法影响基因转录/表达；同时APS孕妇LCHAD mRNA表达水平降低，且CG位点均处于较低甲基化水平，两者水平亦无明显相关性，这一数据证实APS基因表达调控可能还受其他机制影响。
综上所述，合并早发重度子痫前期和HELLP综合征孕妇LCHAD基因甲基化修饰处于高水平，且与mRNA表达密切相关。
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表 1 2组病人一般情况比较(x±s)
分组 n 年龄/岁 身高/cm 体质量/kg 男 女 结肠癌 直肠癌 BMI/(kg/m2) ASA分级 Ⅰ Ⅱ A组 39 55.56±6.25 164.56±8.29 61.00±5.98 20 19 16 23 22.59±2.35 18 21 B组 39 56.79±5.24 164.21±7.09 60.62±5.76 18 21 18 21 22.54±2.38 16 23 t — 0.94 0.20 0.28 0.21△ 0.21△ 0.09 0.21△ P — >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 △示χ2值 
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表 2 2组病人术中及复苏情况各项指标比较(n=39;x±s)
分组 n 平均气腹压/mmHg 平均气道压/cmH2O SRS评分/分 手术时间/min 苯磺顺阿曲库铵用量/mg 恢复指数/min 拔管时间/min PACU驻留时间/min A组 39 12.46±0.86 22.61±2.41 4.64±0.48 201.51±24.32 16.91±2.22 22.12±2.75 32.35±2.52 30.30±4.14 B组 39 8.12±0.29 18.97±3.95 4.51±0.50 198.89±19.70 29.72±3.63 34.38±2.70 48.64±3.67 31.58±3.20 t — 29.56△ 4.90 1.14 0.52△ 18.77△ 19.84 28.98 1.52△ P — < 0.01 < 0.01 >0.05 >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 >0.05 △示t′值
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表 3 2组病人术后疼痛及恶心、呕吐情况比较(x±s；分)
分组 n 肩痛评分 切口痛评分 内脏痛评分 恶心、呕吐评分 术后6 h A组 39 6.23±0.66 5.56±0.75 5.61±0.84 5.94±0.75 B组 39 4.17±0.60 5.28±0.72 4.23±0.70 5.00±0.64 t — 14.26 1.68 7.84 5.93 P — < 0.01 >0.05 < 0.01 < 0.01 术后24 h A组 39 5.25±0.59 4.61±0.87 4.56±0.82 4.87±0.52 B组 39 3.61±0.63 4.38±0.71 3.69±0.61 4.53±0.50 t — 11.79 1.27 5.31△ 2.86△ P — < 0.01 >0.05 < 0.01 < 0.01 术后48 h A组 39 4.00±0.64 3.71±0.85 3.66±0.86 3.53±0.50 B组 39 2.82±0.55 3.43±0.71 3.43±0.59 3.38±0.54 t — 8.62 1.57 1.36△ 1.29 P — < 0.01 >0.05 >0.05 >0.05 术后72 h A组 39 2.48±0.88 2.43±0.59 2.38±0.63 1.35±1.00 B组 39 1.53±0.50 2.38±0.54 2.33±0.47 0.97±0.84 t — 5.81△ 0.39 0.40△ 1.77 P — < 0.01 >0.05 >0.05 >0.05 △示t′值
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表 4 2组病人QoR-15量表评分比较(x±s；分)
分组 n 术前1 d 术后1 d 术后3 d A组 39 137.07±4.79 101.56±5.94 118.56±6.32 B组 39 135.46±5.94 110.23±7.54 127.89±6.05 t — 1.32 5.63 6.65 P — >0.05 < 0.01 < 0.01
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表 5 2组病人术后恢复情况比较(x±s)
分组 n 排气时间/h 排便时间/h 肠鸣音恢复时间/h 住院时间/d A组 39 68.00±5.17 131.66±14.38 57.66±5.55 10.15±1.61 B组 39 57.30±5.42 104.82±14.13 43.94±4.01 8.35±1.20 t — 8.90 8.31 12.49 5.56△ P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 △示t′值
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