Analysis of drug-resistance and macrolide-resistant genes of Streptococcus pneumoniae in preschool children
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摘要:目的了解学龄前儿童肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，Sp）的耐药性及大环内酯类耐药基因分布。方法选取60株Sp，采用E-test法检测菌株对青霉素、阿莫西林、头孢噻肟、头孢曲松的最低抑菌浓度；纸片扩散法检测Sp对红霉素、克林霉素、复方新诺明、四环素、氯霉素、左氧氟沙星、万古霉素、利奈唑胺的药物敏感性；PCR检测大环内酯类耐药基因ermB、mefA和mefE的检出率。患儿按年龄分为0~12个月组、13~36个月组和37~60个月组，比较各组抗菌药物不敏感率和耐药基因检出率。结果药敏试验结果显示，60株Sp对红霉素、四环素和复方新诺明的耐药率较高，分别为95.00%，93.30%，61.07%；Sp对万古霉素、厄他培南、利耐唑胺和泰利霉素均敏感，敏感率为100.00%。0~12个月组儿童对头孢噻肟、头孢曲松、青霉素G、阿莫西林、红霉素、美洛培南不敏感率均高于13~36个月组和37~60个月组，其中3组头孢噻肟、头孢曲松不敏感率差异有统计学意义（P < 0.05），36~60个月组儿童对复方新诺明、氧氟沙星、四环素不敏感率最高。PCR结果显示，大环内酯类耐药基因ermB检出率最高（98.33%），mefA和ermB+mefA测出率均为78.33%，mefE和ermB+mefE检出率均为60.00%，ermB+mefA+mefE检出率最低（46.67%）。mefE和ermB+mefE在0~12个月组、13~36个月组、37~60个月组检出率逐渐降低（P < 0.05）。结论学龄前儿童Sp对大环内酯类耐药率较高，ermB耐药基因为Sp对大环内酯类抗生素耐药的主要基因型。Abstract:ObjectiveTo understand the drug resistance of Streptococcus pneumoniae (Sp) and the distribution of macrolide-resistant genes in preschool children.MethodsSixty Sp strains were selected, and the minimum inhibitory concentrations of penicillin, amoxicillin, cefotaxime and ceftriaxone were detected by E-test method; the susceptibility of Sp to erythromycin, clindamycin, cotrimoxazole, tetracycline, chloramphenicol, levofloxacin, vancomycin and linezolid was detected by disk diffusion method; the detection rate of macrolide-resistant genes ermB, mefA and mefE was determined by PCR.The children were divided into 0 to 12-month group, 13 to 36 month group and 37 to 60-month group according to their age.The antimicrobial insensitivity rate and the detection rate of drug resistance genes in the three groups were compared.ResultsThe results of drug sensitivity test displayed that the 60 strains of Sp showed high drug resistance rate to erythromycin, tetracycline and cotrimoxazole, and the resistance rates were 95.0%, 93.3% and 61.7%, respectively; Sp was sensitive to vancomycin, ertapenem, linezolid and telithromycin, and the sensitivity rate was 100.0%.The insensitivity rates of children to cefotaxime, ceftriaxone, penicillin G, amoxicillin, erythromycin and meropenem in the 0 to 12-month group were higher than those in the 12 to 36-month group and 36 to 60-month group, the difference of insensitivity rates of cefotaxime, ceftriaxone among the three groups was statistically significant (P < 0.05), and the insensitivity rates of children to cotrimoxazole, ofloxacin and tetracycline in the 36 to 60-month group were the highest.The PCR results showed that the detection rate of macrolide-resistant gene ermB was the highest (98.33%), which was 78.33% for mefA and ermB+mefA, 60.00% for mefE and ermB+mefE, and 46.67% for ermB+mefA+mefE.The detection rates of mefE and ermB+mefE gradually decreased in the 0 to 12-month group, 13 to 36-month group and 37 to 60-month group (P < 0.05).ConclusionsThe resistance rate of Sp to macrolide in preschool children is high, and the resistance gene ermB is the main genotype of Sp to macrolide.
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肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，Sp)是儿童呼吸道感染常见致病菌之一，同时也可引起中耳炎、化脓性脑膜炎及血流感染，给病人的生命安全带来了巨大的威胁。据估计，2015年全球约33.5万名 < 5岁儿童死于Sp引起的细菌性肺炎[1]。随抗菌药物的广泛使用，Sp耐药性不断发生变化，Sp耐药菌也被广泛报道，且耐药菌株的产生速度不断增加，导致部分抗菌药物治疗效果不佳，给临床治疗带来很大的困难[2]。本研究分析Sp的耐药性和大环内酯类耐药基因检出情况，为临床Sp感染治疗提供参考。现作报道。
1. 材料与方法
1.1 研究对象
选取2018年1月至2019年6月杭州市西湖区中西医结合医院儿科病人下呼吸道标本分离的Sp。纳入标准: (1)病人年龄≤5岁，剔除重复菌株；(2)病人信息记录完善者。共收集符合条件患儿60例，其中男36例，年龄1~57个月; 女24例，年龄3~60个月。患儿按年龄分为0~12个月组、>12~36个月组和37~60个月组。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器
PICO 17型台式高速离心机和NANO-DROP型超微量分光光度计购自Thermo公司；PAC 3000型电泳仪购自美国Bio-Rad公司；GIS-1600型凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；ABI 7500型PCR扩增仪购自美国ABI公司；MCO-15CA型二氧化碳培养箱购自日本三洋株式会社；GFP-9270型普通培养箱购自上海一恒医疗器械有限公司。
1.2.2 试剂
哥伦比亚血琼脂平板(批号: 070811-2)、药敏培养基为5%绵羊血、MHA培养皿(批号: 1002022190)购自广州迪景生物技术有限公司，青霉素E-test试条购自温州康泰生物科技有限公司。PCR试剂盒KAPA2G Fast Multiplex Mix购自上海益启生物科技有限公司，PCR引物见表 1。
表 1 耐药基因引物基因 引物序列 产物长度/ bp ermB F: 5′-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3′ 639 R: 5′-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3′ mefE F: 5′-GGG AGA TGA AAA GAA GGA GT-3′ 363 R: 5′-TAA AAT GGC ACC GAA AG-3′ mefA F: 5′-TGG TTC GGT GCT TAC TAT TGT-3′ 553 R: 5′-CCC CTA TCA ACA TTC CAG A-3′ 1.3 方法
1.3.1 标本采集
晨起漱口，清除口腔和鼻腔内的分泌物，深呼吸将痰液用力咳出，置于无菌痰杯中；如果是婴幼儿晨起喂奶前由专人用低压吸引器连接一次性无菌吸痰管，经鼻咽部负压吸取痰标本，置消毒试管内。采集到的标本均在1 h内送至微生物实验室室进行痰涂片镜检，白细胞>25个/低倍镜视野，鳞状上皮细胞 < 10个/低倍镜视野为合格标本。
1.3.2 Sp培养和鉴定
将痰标本接种于哥伦比亚血琼脂平板，置于35 ℃含5% CO2孵箱中孵育18~24 h，然后挑选周围有草绿色溶血环、边缘整齐，呈脐窝状的菌落，进行革兰染色，奥普托欣试验进行初筛，结果阳性再用法国生物梅里埃自动细菌鉴定仪VITEK 2 Compact GP卡进行鉴定。
1.3.3 药敏试验
采用E-test法检测Sp对青霉素、头孢曲松及头孢噻肟的最低抑菌浓度；采用纸片扩散法检测Sp对红霉素、克林霉素、复方新诺明、四环素、氯霉素、左氧氟沙星、万古霉素、利奈唑胺的药物敏感性。质控菌株为SpATCC49619，来源于南京便诊生物科技有限公司。抗菌药物敏感性判定依据美国临床和实验室标准委员会2020版判定标准实施和执行。
1.3.4 PCR扩增
(1) DNA提取: Sp在哥伦比亚血琼脂平板上培养24 h，传代后收集整个血平板上菌落，用十六烷基三甲基溴化铵法提取基因组DNA。(2)PCR反应体系: 10×PCR缓冲液5.0 μL，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 200 pmol/L，上、下游引物各50 pmol/L，Taq酶2 U/μL，模板DNA 50 ng/μL。(3)反应条件: 94 ℃预变性5 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、1 min，35次循环；72 ℃延伸5 min[3]。(4)电泳: 将扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶100 V电泳45 min，紫外灯下观察结果，凝胶成像系统扫描成像，选用ATCC49619标准菌株作为阴性对照。
1.4 统计学方法
采用χ2检验和Fisher′s确切概率法。
2. 结果
2.1 60株Sp耐药情况
药敏试验结果显示，60株Sp对红霉素、四环素和复方新诺明的耐药率较高，分别为95.0%，93.3%，61.7%；Sp对万古霉素、厄他培南、利耐唑胺和泰利霉素均敏感，敏感率为100.0%(见表 2)。
表 2 60株Sp耐药情况[n；百分率(%)]抗菌药物 耐药 中介 敏感 复方新诺明 37(61.67) 8(13.33) 15(25.00) 左氧氟沙星 2(3.33) 0(0.00) 58(96.67) 氯霉素 7(11.67) 0(0.00) 53(88.33) 氧氟沙星 2(3.33) 3(5.00) 55(91.67) 万古霉素 0(0.00) 0(0.00) 60(100.00) 莫昔沙星 1(1.67) 0(0.00) 59(98.33) 厄他培南 0(0.00) 0(0.00) 60(100.00) 头孢噻肟 3(5.00) 0(0.00) 57(95.00) 头孢曲松 3(5.00) 0(0.00) 57(95.00) 青霉素G 8(13.33) 6(10.00) 46(76.67) 阿莫西林 5(8.33) 0(0.00) 55(91.67) 红霉素 57(95.00) 1(1.67) 2(3.33) 四环素 56(93.33) 0(0.00) 4(6.67) 利奈唑胺 0(0.00) 0(0.00) 60(100.00) 美洛培南 4(6.67) 5(8.33) 51(85.00) 泰利霉素 0(0.00) 0(0.00) 60(100.00) 2.2 不同年龄组抗菌药物不敏感率比较
0~12个月组儿童对头孢噻肟、头孢曲松、青霉素G、阿莫西林、红霉素、美洛培南不敏感率均高于13~36个月组和37~60个月组，其中3组头孢噻肟、头孢曲松不敏感率差异有统计学意义(P < 0.05)，37~60个月组儿童对复方新诺明、氧氟沙星、四环素不敏感率最高(见表 3)。
表 3 不同年龄组抗菌药物不敏感率比较[n；百分率(%)]分组 n 复方新诺明 左氧氟沙星 氯霉素 氧氟沙星 头孢噻肟 头孢曲松 青霉素G 阿莫西林 红霉素 四环素 美洛培南 0~12个月组 19 15(78.95) 1(5.26) 1(5.26) 1(5.26) 3(15.79) 3(15.79) 5(26.32) 5(26.32) 19(100.00) 18(94.74) 5(26.32) 13~36个月组 17 13(76.47) 1(5.88) 0(0.00) 1(5.88) 0(0.00) 0(0.00) 3(17.65) 0(0.00) 16(94.12) 15(88.23) 3(17.65) 37~60个月组 24 19(79.17) 0(0.00) 1(4.17) 2(8.33) 0(0.00) 0(0.00) 6(25.00) 0(0.00) 22(91.67) 23(95.83) 1(4.17) χ2 — 0.06 — — — — — 0.44 11.77 — 0.93 4.21 P — >0.05 >0.05△ >0.05△ >0.05△ < 0.05△ < 0.05△ >0.05 >0.05 >0.05△ >0.05 >0.05 △示Fisher′s确切概率法 2.3 Sp耐药基因检测结果
检测的Sp大环内酯类三个基因分别为ermB、mefE与mefA，结果表明，ermB检出率最高(98.33%)，mefA和ermB+mefA测出率均为78.33%，mefE和ermB+mefE检出率均为60.00%，ermB+mefA+mefE检出率最低(46.67%)。mefE和ermB+mefE在0~12个月组、13~36个月组、37~60个月组检出率逐渐降低(P < 0.05)(见表 4)。
表 4 不同年龄组耐药基因检出率比较[n；百分率(%)]分组 n ermB mefE mefA ermB+mefA ermB+mefE ermB+mefA+mefE 0~12个月组 19 19(100.00) 15(78.94) 14(73.68) 14(73.68) 15(78.94) 9(47.37) 13~36个月组 17 16(94.12) 11(64.71) 12(70.59) 12(70.59) 11(64.71) 9(52.94) 37~60个月组 24 24(100.00) 10(41.67) 21(87.50) 21(87.50) 10(41.67) 10(41.67) 合计 60 59(98.33) 36(60.00) 47(78.33) 47(78.33) 36(60.00) 28(46.67) χ2 — — 6.36 2.03 2.03 6.36 0.51 P — >0.05△ < 0.05 >0.05 >0.05 < 0.05 >0.05 △示Fisher′s确切概率法 2.4 Sp耐药基因电泳结果
本研究共检测3种耐药基因，ermB、mefE与mefA基因产物长度分别为639、363、553 bp，电泳结果见图 1。
3. 讨论
近年来，我国抗菌药物滥用日趋严重，随着临床上抗菌药物的大量应用，儿童感染Sp多重耐药率逐渐升高，导致相关感染控制难度增大，已成为全球性问题[4-5]。本研究分离的60株Sp药敏结果表明，红霉素耐药率为95.00%，与KIM等[6]在亚洲耐药病原体监测网络研究报道我国Sp的红霉素耐药率(96.4%)结果一致。除红霉素表现高度耐药外，四环素耐药率也保持高位，本次检测四环素耐药率为93.33%，高于王扬帆等[7]报道的86.54%。究其原因，一方面可能不同分离菌株间存在差异，另一方面可能不同地区医疗、养殖和环境中抗生素的使用有关。由于Sp对红霉素高度耐药，在临床治疗中应避免使用，研究中未检测到耐万古霉素、厄他培南、利耐唑胺及泰利霉素菌株，这为临床治疗Sp感染相关疾病提供了更多的用药选择。
本研究中，不同年龄组抗菌药物不敏感率比较表明，0~12月儿童对头孢噻肟、头孢曲松、阿莫西林不敏感率高于12~36月和36~60月年龄组(P < 0.05)，可能与当地生活节奏快，工作压力大，许多家庭6~12月儿童，用奶粉或辅食代替母乳喂养。另外，该时期免疫系统发育尚未完善，特别容易患呼吸道疾病(如咳嗽、打喷嚏、流涕、发热等感冒症状及肺炎等)和胃肠道疾病(如腹泻等)，导致该时期的婴幼儿，经常使用抗生素，从而对许多抗菌药物产生耐药和中介现象，引起不敏感率增加。由于本研究的标本数量有限，不同年龄组的不敏感率比较需要再收集标本进一步分析。
Sp对大环内酯类的耐药是通过多种不同的耐药机制完成的。耐药机制主要包括核糖体靶位改变和主动外排系统。另外，IZE-IYAMU等[8]报道转座子在Sp耐药进化中起重要作用，与质粒DNA无关的耐药性传递主要由转座因子完成。不同地区检测的红霉素Sp的耐药基因结果有所同，多数欧洲和亚洲国家以ermB介导为主，美国、中国香港等地以mefA为主。本研究分离的60株Sp，采用PCR法检测大环内酯类耐药基因ermB、mefA和mefE，结果表明，耐药基因携带率以ermB最高(98.33%)，与WANG等[9]报道的100.0%及黄阿环等[10]报道的98.1%一致，但高于宋彬容[11]报道的87.5%与BAO等[12]报道的70.2%，表明ermB基因为很多地区Sp耐红霉素的主要原因，另外在不同地区也存在着很大的差异。mefA和mefE携带率分别为78.33%与60.00%，高于赖玉华[13]报道的mefA 6.1%和mefE 44.7%，可能与不同地区菌株差异有关。另外28株同时检测到耐药基因ermB、mefA和mefE，占比46.67%，表明该地区Sp对大环内酯类抗生素耐药现象严重，且耐药机制复杂；1株耐红霉的Sp均未检到ermB、mefA和mefE耐药基因，可能存在其他的耐药基因或耐药机制，有待于进一步研究。本研究中，不同年龄组的耐药基因比较发现，mefE与ermB+mefE在不同年龄组差异有统计学意义，且0~12月组比13~36月与37~60月组高，与上述讨论的不同年龄组耐药率0~12月组高于其他2组较为一致，因此，0~12月患儿治疗Sp感染疾病尽量避免大环内酯类药物使用。
综上，学龄前儿童Sp对大环内酯类耐药率与耐药基因携带率均处于高位，对青霉素耐药率较低，对万古霉素、厄它培南、利耐唑胺及泰利霉素均未出现耐药菌，因此，临床在治疗Sp感染相关疾病时，必须加强耐药监测。
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表 1 耐药基因引物
基因 引物序列 产物长度/ bp ermB F: 5′-GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA-3′ 639 R: 5′-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC-3′ mefE F: 5′-GGG AGA TGA AAA GAA GGA GT-3′ 363 R: 5′-TAA AAT GGC ACC GAA AG-3′ mefA F: 5′-TGG TTC GGT GCT TAC TAT TGT-3′ 553 R: 5′-CCC CTA TCA ACA TTC CAG A-3′ 
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表 2 60株Sp耐药情况[n；百分率(%)]
抗菌药物 耐药 中介 敏感 复方新诺明 37(61.67) 8(13.33) 15(25.00) 左氧氟沙星 2(3.33) 0(0.00) 58(96.67) 氯霉素 7(11.67) 0(0.00) 53(88.33) 氧氟沙星 2(3.33) 3(5.00) 55(91.67) 万古霉素 0(0.00) 0(0.00) 60(100.00) 莫昔沙星 1(1.67) 0(0.00) 59(98.33) 厄他培南 0(0.00) 0(0.00) 60(100.00) 头孢噻肟 3(5.00) 0(0.00) 57(95.00) 头孢曲松 3(5.00) 0(0.00) 57(95.00) 青霉素G 8(13.33) 6(10.00) 46(76.67) 阿莫西林 5(8.33) 0(0.00) 55(91.67) 红霉素 57(95.00) 1(1.67) 2(3.33) 四环素 56(93.33) 0(0.00) 4(6.67) 利奈唑胺 0(0.00) 0(0.00) 60(100.00) 美洛培南 4(6.67) 5(8.33) 51(85.00) 泰利霉素 0(0.00) 0(0.00) 60(100.00)
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表 3 不同年龄组抗菌药物不敏感率比较[n；百分率(%)]
分组 n 复方新诺明 左氧氟沙星 氯霉素 氧氟沙星 头孢噻肟 头孢曲松 青霉素G 阿莫西林 红霉素 四环素 美洛培南 0~12个月组 19 15(78.95) 1(5.26) 1(5.26) 1(5.26) 3(15.79) 3(15.79) 5(26.32) 5(26.32) 19(100.00) 18(94.74) 5(26.32) 13~36个月组 17 13(76.47) 1(5.88) 0(0.00) 1(5.88) 0(0.00) 0(0.00) 3(17.65) 0(0.00) 16(94.12) 15(88.23) 3(17.65) 37~60个月组 24 19(79.17) 0(0.00) 1(4.17) 2(8.33) 0(0.00) 0(0.00) 6(25.00) 0(0.00) 22(91.67) 23(95.83) 1(4.17) χ2 — 0.06 — — — — — 0.44 11.77 — 0.93 4.21 P — >0.05 >0.05△ >0.05△ >0.05△ < 0.05△ < 0.05△ >0.05 >0.05 >0.05△ >0.05 >0.05 △示Fisher′s确切概率法
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表 4 不同年龄组耐药基因检出率比较[n；百分率(%)]
分组 n ermB mefE mefA ermB+mefA ermB+mefE ermB+mefA+mefE 0~12个月组 19 19(100.00) 15(78.94) 14(73.68) 14(73.68) 15(78.94) 9(47.37) 13~36个月组 17 16(94.12) 11(64.71) 12(70.59) 12(70.59) 11(64.71) 9(52.94) 37~60个月组 24 24(100.00) 10(41.67) 21(87.50) 21(87.50) 10(41.67) 10(41.67) 合计 60 59(98.33) 36(60.00) 47(78.33) 47(78.33) 36(60.00) 28(46.67) χ2 — — 6.36 2.03 2.03 6.36 0.51 P — >0.05△ < 0.05 >0.05 >0.05 < 0.05 >0.05 △示Fisher′s确切概率法
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百度学术
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